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实验介绍        苏木精-伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ,简称HE染色法 ,石蜡切片技术里常用的染色法之一 。苏木精染液为碱性 ,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色 ;伊红为酸性染料 ,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。       细胞中的细胞核是由酸性物质组成,它与碱性染料(苏木素)的亲和力较强。而细胞浆则相反,它含有碱性物质,和酸性染料(伊红)的亲和力较大。因此细胞或组织切片经苏木素-伊红染色液染色后,细胞核被苏木素染成鲜明的蓝紫色,细胞浆、肌纤维、胶原纤维等呈不同程度的红色。如何处理组织样本?首先需要快速取材,然后尽快的放入适量的固定液中固定,固定液需根据不同组织类型选择合适的固定液。下面给大家列举几种常见组织的固定液选择方法: 1、眼球固定液选择:FAS眼球固定液注 意 事 项:将眼球组织轻柔摘取后放入FAS眼球固定液中固定24H,结合本公司制片时的特殊手法结果更有保障,固定液是组织的10-20倍。 2、肌肉   固定液选择:GD固定液注 意 事 项:将新鲜肌肉组织取下后放入GD固定液中固定24H以上,固定液是组织的10-20倍。 3、睾丸固定液选择:Bouin's固定液注 意 事 项:固定24H后转移至75%酒精保存运输,固定液是组织的10-20倍。 4、脂肪固定液选择:脂肪专用固定液注 意 事 项:将新鲜脂肪组织取下后放入脂肪专用固定液中固定24H以上,需要使用脱脂棉花将组织压在固定液中,固定液是组织的10-20倍。 5、骨、牙齿组织固定液选择:通用型组织固定液注 意 事...
实验原理       免疫组化,是应用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使结合抗体的显色剂进行显色来确定组织或细胞内抗原,对其进行定位、定性及相对定量的研究。是生命科学研究中常用且重要的实验方法。显然,免疫组化(IHC)结果获取过程中最关键的步骤是使用正确的抗体和抗原特异结合并对信号进行放大,但其实免疫组化(IHC)过程中所有的步骤对于生成出色的图像结果都十分重要。免疫组化(IHC)染色经常很难获得最优的结果,但通常可以通过对一些实验流程的变量(例如样品制备、抗原修复以及孵育时间等)进行调整实现优化。实验步骤  技术优势1. 特异性强免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性,因此,免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示,如角蛋白(keratin)显示上皮成分,LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时,才会出现交叉反应。2. 敏感性高在应用免疫组化的起始阶段,由于技术上的限制,只有直接法、间接法等敏感性不高的技术,那时的抗体只能稀释几倍、几十倍;现在由于ABC法或SP三步法的出现,使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合,这样高敏感性的抗体抗原反应,使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3. 定位准确、形态与功能相结合       该技术通过抗原抗体反应及呈色反应,可在组织和细胞中进行抗原的准确定位,因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察,这样就可以进行形态与功能相结合的研究,对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。客户提供1 、待进行免疫组化的实验材料及材料信息,我们接受以下形式的实验材料组织标本根据抗原来选择适宜的固定液,时间以12-24h左右最佳细胞片固定后...
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位,以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。       免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步,细胞片的质量对实验的成败至关重要,原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力,有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门,非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法,合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的,最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作,此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是,标记好荧光的细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。       由于操作步骤比较多,同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别,所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果,除了需要高质量的抗体,以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨的实验对照。总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个步骤的质量...
技术原理       石蜡切片(paraffin section)是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构,也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法,而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。活的细胞或组织多为无色透明,各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差,在一般光镜下不易清楚区别出;组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败,失去原有正常结构,因此,组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡,而能清晰辨认其形态结构。冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂,将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程,大大缩短了制片时间。同时,由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤,因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片,并作为快速切片的方法应用在临床诊断特点       石蜡切片标本可以长期保存使用,为永久性显微玻片标本。       冰冻切片制作过程较石蜡切片快捷、简便,而多应用于手术中的快速病理诊断.组织变化不大,能很好保存脂肪,类脂等成分。能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类,特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。 石蜡切片(paraffin section)       组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构,也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法,而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中,光镜下观察切片标本多...
实验原理       将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,称为原位杂交。使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。       RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是:在细胞或组织结构保持不变的条件下,用标记的已知的RNA核苷酸片段,按核酸杂交中碱基配对原则,与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交),所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术 经不断改进,其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析,已 成为最有效的分子病理学技术,同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。原位杂交实验步骤:前期胚胎的制备。       原位杂交第一天进行重新水化和固定、预杂交、杂交。       原位杂交第二天进行 1 将探针回收,放于-20C保存(通常探针可重复使用十次左右)2加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升,60℃,放置30分钟,重复一次。3置换2XSSCT1ml,60℃,放置15分钟。4置换0.2XSSCT1ml,60℃,放置30分钟,重复一次。5用MABT洗两次,每次五分钟,放在摇床轻轻摇动。6室温下加1ml 1:2:7溶液,时间为一小时。  7  按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶连地高辛抗体,4C 冰箱过夜。    ...
原位末端标记染色(TUNEL) TUNEL原理       细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ,从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测,这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。常见问题1、出现非特异性荧光标记a. 有些细胞或组织,例如平滑肌细胞或组织,nuclease或polymerase的酶活性水平较高,易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是,取细胞或组织后立即固定并且要充分固定,以阻止这些酶导致假阳性。b. 使用了不适当的固定液,例如一些酸性固定液,导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。c. TUNEL检测反应时间过长,或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润,也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间,并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。2、荧光背景很高a. 支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。b. 高速分裂和增殖的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA断裂。c. TUNEL反应过强。可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后的TdT酶需当日使用。d. 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。 3、标记效率低a. 使用乙醇或甲醇固定会导致标记...
实验原理       将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,称为原位杂交。使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是:在细胞或组织结构保持不变的条件下,用标记的已知的RNA核苷酸片段,按核酸杂交中碱基配对原则,与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交),所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术 经不断改进,其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析,已 成为最有效的分子病理学技术,同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。 原位杂交实验步骤:前期胚胎的制备。       原位杂交第一天进行重新水化和固定、预杂交、杂交。       原位杂交第二天进行 1 将探针回收,放于-20C保存(通常探针可重复使用十次左右)2加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升,60℃,放置30分钟,重复一次。3置换2XSSCT1ml,60℃,放置15分钟。4置换0.2XSSCT1ml,60℃,放置30分钟,重复一次。5用MABT洗两次,每次五分钟,放在摇床轻轻摇动。6室温下加1ml 1:2:7溶液,时间为一小时。  7  按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶连地高辛抗体,4C 冰箱过夜。       原位杂交第三天进行1) ...
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