常见问题FAQ-CCK-8

日期: 2019-03-18
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常见问题FAQ

 

Q : CCK-8试剂盒检测细胞增殖和毒性的优点有哪些?

A : CCK-8较传统的MTT法优点在于1) MTT被线粒体内的一些脱氢还原酶还原成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶解液来溶解,而CCK-8产生的formazan都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤; 2) CCK-8检测灵敏度更高,更加稳定; 3)酚红和血清对其测定无明显影响; 4)不必去上清,不必洗,涤细胞,更加简便; 5)对细胞无明显毒性,加入显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读板,使检测时间更加灵活,而且不影响细胞进行后续实验。

 

Q :在做细胞的加药实验时,药物对CCK-8测定是否有影响?如何解决?

A :1)注意如果药物具有还原性(如维生素C),会和CCK-8发生显色反应,增加吸光度。2)药物中的金属对CCK-8显色有影响:当终浓度为1mM的氯化亚铅、氧化铁、硫酸铜会抑制5%,15%, 90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10mM的话,将会100%抑制。解决办法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK-8,测定450nm的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培养基(加CCK-8)的吸光度高,则证明药物有影响,可在加CCK-8之前更换培养基,去掉药物的影响。3)由于培养基中可能含有氧化还原反应的物质,在正式实验之前,建议使用一个孔作一下检测,有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常的0D值应该在0.4以下。

 

Q : CCK-8如何设定空白对照?

A :在不含细胞的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度作为空白对照。

 

Q : CCK-8对于不同的细胞,灵敏度是否一样?

A :不一样,悬浮细胞较贴壁细胞难染色。对于贴壁细胞,一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

 

Q :可否采用CCK-8法进行肿瘤细胞的基质黏附实验?

A :可以,以层粘连蛋白(Ln)包被96孔板,通过计算不同时间点孔板中贴壁细胞的数量反映细胞的黏附性。细胞的黏附性越强,则单位时间内贴于铺有Ln板底的细胞数量越多,去除尚未贴壁的细胞后,应用CCK-8等方法计量细胞数量便可间接反映不同细胞或不同处理的细胞黏附能力的差异。

 

Q :可否采用CCK-8法进行药物的IC50检测?

A :可以,将细胞培养后按照不同浓度的药物处理-定时间后进行CCK-8检测,根据吸光度绘制曲线,计算该药物抑制细胞数量一半时的浓度(IC50)。

实验问题

原因

推荐解决方法

吸光度值过低?

细胞数量过低

增加待测细胞数量。

染色难度大

延长CCK-8试剂的孵育时间。

CCK-8数据重复性差

使用外圈容易挥发的孔

最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。

CCK-8沾壁

加入CCK-8后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。

细胞数量过多或过少

预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。

孔内气泡干扰酶标仪检测

检测前需确保每个孔内无气泡。

 


Case / 精彩案例
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